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低温冷却液循环泵制备葡萄糖氧化酶担子菌
科瑞仪器 / 2019-04-30 09:26/ QQ在线报价

技术领域
[0001]本发明涉及一种使用低温冷却液循环泵进行微生物筛选及发酵领域,具体涉及一种野生酵母菌株担子菌。
背景技术
[0002]葡萄糖氧化酶是需氧脱氢酶,利用氧作为电子受体,专一性地将葡萄糖氧化成葡萄糖酸和过氧化氢,在此过程中葡萄糖氧化酶起到了去除葡萄糖、脱氧、杀菌等作用。由于其天然无毒副作用及其独特的脱氧效果而产生的保鲜作用被广泛地用于食品加工领域。
[0003]目前葡萄糖氧化酶的工业化生产菌株主要为陆地来源的霉菌,其培养温度较高,表达量较低,杂蛋白较多,造成分离纯化困难,生产成本高且无法直接应用于食品领域。海洋来源的葡萄糖氧化酶研究相对较少,野生非转基因酵母生产菌株更是鲜有报道。目
前我国生产的葡萄糖氧化酶工业酶制剂纯度普遍较低,长期以来依赖进口,因此寻找葡萄糖氧化酶进口酶制剂的替代产品具有重要现实意义。
发明内容
[0004]为解决上述问题,本发明提供了一种从海洋资源中分离葡萄糖氧化酶的菌株及其应用。
[0005]一株产葡萄糖氧化酶的野生酵母菌株担子菌(Basidioascussp.)WYQ23菌株,该菌株于2019年1月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通徼生物中心,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所,邮编:100101,保藏中
 
心登
记入册编号:CGMCCNo.17180。
[0006]将得到的该菌序列在NCBI上进行比对,查找同源性最高的己知序列菌株,经对比,该菌株与Basidioascussp.相似度最高,达99%。该菌株ITS区序列己申请GenBank号,为SUB4615397SeqlMK038973。
[0007]WYQ23菌株从大连渤海海域的海泥(经度121.662527,纬度38.861911)取样用显色筛选固体培养基进行筛选。
[0008]显色筛选固体培养基:葡萄糖60-80g/L,蛋白胨3-4g/L,KH2P042-3g/L,MgS040.5-0.7g/L,KCI0.5-0.7g/L,NaN033-4g/L,CaC033-4g/L,可溶性淀粉8-lOg/L,脱氧胆酸钠0.2-0.3g/L,海水配制,pH自然,121。C灭菌20min。
[0009]WYQ23菌株具有下述特性:
[0010]1.菌落形态学特征
[0011]将产葡萄糖氧化酶的野生酵母菌株担子菌(Basidioascussp.)WYQ23菌株置于YPD圃体培养基上于25。C培养生长,Q—7天后得到直径约为4-lOmm的褐色菌落,菌落呈圆形,扁平,较不透明,表面较光滑,正面与反面以及边缘与中央部位的颜色较一
 
致。
[0012]2.菌株形态学特征
[0013]本发明的WYQ23菌株显微镜下呈卵圆形,与酵母菌镜下形态一致。
[0014]3.生理与生化特性
[0015]本发明的WYQ23菌株培养温度为20-25。C,最适生长温度为25。C,且在pH5.6的条件下生长良好。
[0016]4.该WYQ23菌株ITS区具有如SEQID:I所示的核苷酸序列。
[0017]所述的产葡萄糖氧化酶的野生酵母菌株担子菌(Basidioascussp.)WYQ23菌株用于制备葡萄糖氧化酶的方法,包括以下步骤:
[0018](1)种子液培养(YPD培养基):
[0019]将葡萄糖10-20g/L,酵母粉10-20g/L,蛋白胨10-20g/L,海水配制,pH自然,121。C灭菌20min。培养温度25。C,转速160r/min-180r/min,培养时间24-48h,得到种子液。
[0020](2)发酵液培养(发酵液培养基)
[0021]将葡萄糖40-60g/L,蛋白胨3-4g/L,CaC036-lOg/L,MgS040.6-0.7g/L,KCI0.3-0.4g/L,KH2P043-4g/L,NaN033-4g/L,海水配制,pH自然,121。C灭菌20min。培养温度25。C,转速160r/min-180r/min,接种量1-3mL,培养时间36-48h,得刭发酵液。
[0022](3)酶液制备
[0023]发酵完成后,将发酵液在4。C,4000r/min的条件离心lOmin-20min,弃去沉淀,上清液即为葡萄糖氧化酶酶液。
[0024]本发明的有益效果包括:
[0025]1.本发明首次实现担子菌产葡萄糖氧化酶。
[0026]2.本发明提供的产糖氧化酶的野生酵母菌株担子菌(Basidioascussp.)WYQ23菌株遗传稳定性良好,能稳定的保持其产葡萄糖氧化酶的优良性状。
[0027]3.本发明简单高效,节能环保,制备出的葡萄糖氧化酶纯化容易,在下具有良好的酶活活性,在食品、饲料、医疗等行业有广泛的应用前景,经济和社会效益显著。
附图说明
[0028]图1为产葡萄糖氧化酶的野生酵母菌株担子菌(Basidioascussp.)WYQ23菌株的菌落照片,A为正面、B为背面;
[0029]图2为产葡萄糖氧化酶的野生酵母菌株担子菌(Basidioascussp.)WYQ23菌株的点接照片
[0030]图3为产葡萄糖氧化酶的野生酵母菌株担子菌(Basidioascussp.)WYQ23菌株的10~100光学显微镜照片;
[0031]囹4为产葡萄糖氧化酶的野生酵母菌株担子菌(Basidioascussp.)WYQ23菌株的2000~电镜照片;
[0032]图5为产葡萄糖氧化酶的野生酵母菌株担子菌(Basidioascussp.)WYQ23菌株的5000~电镜照片;
[0033]图6为利用MEGA5软件构建的系统发育树;
[0034]图7为不同碳源对菌株WYQ23菌株产酶的影响示意图;
[0035]图8为不同葡萄糖浓度对WYQ23菌株产酶的影响示意图;
[0036]图9为不同有机氮源对WYQ23菌株产酶的影响示意图;
[0037]图10为不同蛋白胨浓度对WYQ23菌株产酶的影响示意图;
[0038]图11为不同无机氮源对WYQ23菌株产酶的影响示意图;
[0039]图12为不同NaN03浓度对WYQ23菌株产酶的影响示意图;
[0040]图13为不同KH2P04浓度对WYQ23菌株产酶的影响示意图;
[0041]图14为不同KCI浓度对WYQ23菌株产酶的影响示意图;
[0042]图15为不同MgS04浓度对WYQ23菌株产酶的影响示意图;
[0043]图16为不同CaC03浓度对WYQ23菌株产酶的影响示意图;
[0044]图17为不同初始pH对WYQ23菌株产酶的影响示意图;
[0045]图18为不同培养温度对WYQ23菌株产酶的影响示意图。
具体实施方式
[0046]下面结合实施例与说明书附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述。
[0047]一种产葡萄糖氧化酶的野生酵母菌株担子菌(Basidioascussp.)WYQ23菌株,该菌株于2019年1月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所,邮编:100101,保藏中
 
心登
记入册编号:CGMCCNo.17180。
[0048]一、产葡萄糖氧化酶的酵母菌株的筛选
[0049]本发明产葡萄糖氧化酶的野生酵母菌株担子菌(Basidioascussp.)WYQ23茵株的筛选方法包括以下步骤:
[0050](1)富集:称取19海泥样品于装有9mL无菌海水的锥形瓶中,振荡混匀后取ImL-3mL混合样液接种至YPD培养基,160r/min-180r/min过夜培养。
[0051](2)初筛:将各富集培养基稀释至10-2、10-3、10-4、10-5浓度,混匀后将不同浓度的样液各取150uL-200uL分别涂布于显色筛选固体培养基中,于25。C倒置培养Q—7天。
[0052](3)复筛:将有显色反应的菌株接种于YPD培养基,于25。C培养24h后,接种于发酵液培养基,于25。C培养38h后,在4。C,4000r/min离心lOmin,取上清用酶联反应法测酶活,筛选出葡萄糖氧化酶酶活最高的菌株。最终,筛选到编号为WYQ23的酵母菌株。
[0053]所述的YPD培养基:将葡萄糖29、酵母粉19、蛋白胨29加50mL海水溶解定容至lOOmL,pH自然,121。C灭菌20min。
[0054]显色筛选固体培养基:将葡萄糖89,蛋白胨0.3g,KH2P040.2g,MgS040.07g,KCI0.05g,NaN030.4g,CaC033.5g.可溶性淀粉19,脱氧胆酸钠0.02g,加50mL海水溶解定容至lOOmL,pH自然,121。C灭菌20min。
[0055]发酵液培养基:将葡萄糖49、蛋白胨0.4g、CaC030.6g、MgS040.07g、KCI0.03g、KH2P040.3g、NaN030.3g加50mL海水溶解定容至lOOmL,pH自然,121。C灭菌20min。
[0056]二、产葡萄糖氧化酶酵母WYQ23菌株的鉴定
[0057]形态学鉴定:菌落呈圆形,扁平,较不透明,表面较光滑,正面与反面以及边缘与中央部位的颜色较一致,如图1所示。菌株在YPD固体培养基上于25。C培养生长,Q-7天后得到直径约为4-lOmm的褐色菌落,如图2所示。菌株显微镜下呈卵圆形,与酵母菌镜下形态一
 
致,
如图3-5所示。
[0058]分子生物学鉴定:采用真菌DNA提取试剂盒提取基因组DNA,然后采用通用引物进行PCR扩增及测序。将得到的该菌序列在NCBI上进行比对,查找同源性最高的己知序列菌株。经对比,该菌株与Basidioascussp.相似度最高,达99%。该菌株ITS区序列己申请enBank号
 
,为SUB4615397SeqlMK038973。利用MEGA5软件构建系统发育树,如图6所示。
[0059]三、葡萄糖氧化酶的制备
[0060]本发明所述的产葡萄糖氧化酶的野生酵母菌株担子菌(Basidioascussp.)
WYQ23菌株用于制备葡萄糖氧化酶的方法,包括以下步骤:
[0061](1)种子液培养:
[0062]首先,获取单菌落:将葡萄糖89、蛋白胨0.3g、KH2P040.2g、MgS040.07g、KCI0.05g、NaN030.4g、CaC030.35g、可溶性淀粉19、脱氧胆酸钠0.02g,加50mL海水溶解定容至lOOmL,pH自然,121。C灭菌20min,倒平板,待凝固后,用接种环挑取菌株WYQ23进行三区划
 
线,得到菌株WYQ23的单菌落。
[0063]种子液培养:
[0064]将葡萄糖29、酵母粉19、蛋白胨29,加50mL海水溶解定容至lOOmL,pH自然,121。C灭菌20min。挑取菌株WYQ23的单菌落接种,培养温度25。C,转速160r/min-180r/min,培养时间24h,得到种子液。
[0065](2)发酵液培养
[0066]将荀萄糖49、蛋白胨0.4g、CaC030.6g、MgS040.07g、KCI0.03g、KH2P040.3g、NaN030.3g,加50mL海水溶解定容至lOOmL,pH自然,121。C灭菌20min。培养温度25。C,转速160r/min-180r/min,接种量ImL,培养时间38h,得到发酵液。
[0067](3)酶液制备
[0068]发酵完成后,将发酵液在4。C,4000r/min的条件离心lOmin,弃去沉淀,上清即为葡萄糖氧化酶酶液。
[0069]四、葡萄糖氧化酶酶活的测定
[0070]根据酶联反应测酶活。葡萄糖氧化酶在氧气的存在下催化葡萄糖生成无色的H202和葡萄糖酸,H202在辣根过氧化物酶的存在下与无色的还原型邻联茴香胺生成红色的氧化型邻联茴香胺,其显色程度与产生的H202量呈正相关。酶活力的定义为每分钟催化产生l.Ou
gH202的量即为一个酶活力单位。
[0071]五、发酵培养基最适条件单因素优化
[0072]发酵培养基最适碳源:其他条件不变,以6%的添加量分别加入葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、乳糖、麦芽糖,培养温度25。C,转速160r/min,接种量1%,培养时间38h,测走酶活。
结果如图7所示,表明葡萄糖为最适碳源。
[0073]发酵培养基最适碳源浓度:其他条件不变,分别以20A、4%、6%、8%、10%的添加量加入葡萄糖,培养温度25。C,转速160r/min,接种量1%,培养时间38h,测定酶活。结果如图8所示,表明4%为最适碳源浓度。
[0074]发酵培养基最适有机氮源:其他条件不变,以0.3%的添加量分别加入蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、尿素、玉米膏,培养温度25。C,转速160r/min,接种量1%,培养时间38h,测定酶活。结果如图9所示,表明蛋白胨为最适有机氮源。
[0075]发酵培养基最适有机氮源浓度:其他条件不变,分别以0.2%、0.3%、0.40/、0.50/、0.6%的添加量加入蛋白胨,培养温度25。C,转速160r/min,接种量1%,培养时间38h,测定酶活。结果如图10所示,表明0.40/为最适有机氮源浓度。
[0076]发酵培养基最适无机氮源:其他条件不变,以0.4/0的添加量分别加入NaN03、KN03、NH4CI、(NH4)2S04、NH4N03,培养温度25。C,转速160r/min,接种量1%,培养时间38h,测定酶活。结果如图II所示,表明NaN03为最适无机氮源。
[0077]发酵培养基最适无机氮源浓度:其他条件不变,分别以0.2%、0.3%、0.40/、0.50/、0.60/的添加量加入NaN03,培养温度25。C,转速160r/min,接种量1%,培养时间38h,测定酶活。结果如图12所示,表明0.3%为最适无机氮源浓度。
[0078]发酵培养基最适KH2P04浓度:其他条件不变,分别以0.10/、0.150/、0.2%、0.25%、0.30/的添加量加入KH2P04,培养温度25。C,转速160r/min,接种量1%,培养时间38h,测定酶活。结果如图13所示,表明0.30/为最适KH2P04浓度。
[0079]发酵培养基最适KCI浓度:其他条件不变,分别以0.010/、0.03/0、0.050/、0.070/、0.090/的添加量加入KCI,培养温度25。C,转速160r/min,接种量1%,培养时间38h,测定酶活。结果如图14所示,表明0.030/为最适KCI浓度。
[0080]友酵培养基最适MgS04浓度:其他条件不变,分别以0.01%、0.030/、0.05%、0.070/、0.090/的添加量加入MgS04,培养温度25。C,转速160r/min,接种量1%,培养时间38h,测定酶活。结果如图15所示,表明0.070/为最适MgS04浓度。
[0081]发酵培养基最适CaC03浓度:其他条件不变,分别以0.30/、0.6%、0.9%、1.2%、1.50/的添加量加入CaC03,培养温度25。C,转速160r/min,接种量1%,培养时间38h,测定酶活。结果如图16所示,表明0.6%为最适CaC03浓度。
[0082]发酵培养基最适初始pH:其他条件不变,调节发酵初始pH分别为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5,培养温度25。C,转速160r/min,接种量1%,培养时间38h,测定酶活。结果如图17所示,表明pH5.6为最适初始pH。
[0083]发酵最适培养温度:其他条件不变,调节发酵温度分别为15。C、20。C、25。C、30。C、35。C,转速160r/min,接种量1%,培养时间38h,测定酶活。结果如图18所示,表明25。C为晟适培养温度。
[0084]六、发酵培养基最适条件正交试验优化
[0085]在培养基单因素成分优化的基础上,以菌体产葡萄糖氧化酶的酶活为指标,选择葡萄糖(A)、蛋白胨(B)、NaN03(C)的三个浓度及发酵温度(D)采用L9(34)正交实验表进行实验优化,确定最佳发酵培养基成分,正交试验因素与水平见表1。
[0086]表1发酵条件正交实验表
[0087]
120.30.220
240.40.325
360.50.430
[0088]根据单因素实验优化结果,选择葡萄糖、蛋白胨、NaN03的三个浓度及发酵温度采用L9(34)正交实验表进行实验优化,确定最优发酵条件。实验设计及结果如表2。根据正交试验的直观分析结果,根据极差值可知各因素对WYQ23菌株产酶的影响次序为温度>NaN03>
葡萄糖>蛋白胨,最优培养基组合为A2BIC2D2,即葡萄糖4%,蛋白胨0.3/0,NaN030.3%,温度25。C。在此优化条件下,酶活达到1.67U/mL,试验结果较理想。
[0089]表2发酵条件正交实验表
[0090]
编号ABcDGOD酶活(U/mL)
112121.53
223221.63
331321.43
413331.04
521131.49
632231.39
711210.63
822310.52
933110.46
10l.0671.1831.1600.537
111.2131.1471.2671.530
121.0931.0430.9971.307
130.1470.1400.2200.993
<110>大连学大
<120>-株产葡萄糖氧化酶的担菌
<160>I
<170>SIPOSequenceListingl.0
<210>I
<211>600
<212>DNA
<213>序列(ArtificialSequence)
<400>
gtcttcggactcatcttcattatccacacacacctgtgcacctttgattcgagtactggt60
tattagagcttcggctcgagtgctagtgcttgtctcaatatcaatcttcaaaacaatgtt120
ttctagaatgtatactgtctcgttgtaatgacgagtacaacccctataaaactttcaaca180
acggatctcttggctcaggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaa240
ttgcagaatccagtgaatcatcgaatctttgaacgcaccttgcgccccttggtattccga300
ggggcacacctgttggagtgtcatgaatacctcaacccttataggttttatcgcttataa360
ggtgttggttgtgagcgtttgcaggtcgcaagatcggctcgctttaaaatcattagctgg420
atccactttgacctggttctactcggcgtaataagttattatcgttgaggacacttttct480
taggaagggtggccacagtaaaggttgcgaaccgcttctaatatgtctgcttagtcttcg540
ggctatgcaacactttttatctctgacctccaatcaggtgggactacccgctgaacttaa600
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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